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作者: 李启明 李宁
题目: 干细胞、肿瘤干细胞与高压氧微环境
刊名: 重庆医学
时间: 2005
期数: 2005(05)

干细胞、肿瘤干细胞与高压氧微环境

李启明[1]  李宁[2]综述  程天民1 粟永萍1审校

1第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所,  创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室

2.第三军医大学新桥医院, 高压氧中心  重庆,400038

干细胞可以分为胚胎干细胞与成体干细胞;在骨髓的成体干细胞中有造血干细胞与基质干细胞;后者又被称为间充质干细胞;近年来发现间充质具有多向分化的潜能即有明显的可朔性,可以分化为神经细胞、脂肪细胞、骨细胞、肌肉细胞等[1-3];在许多组织如肝脏、皮肤、肠道、肺、胰腺等均可以分离出间充质干细胞。胚胎干细胞向成体干细胞分化及成体干细胞向不同类型的成熟细胞分化均依赖于所处的微环境;分化方向的确定是微环境与干细胞内外因素相互作用的结果[4-7];肿瘤细胞在机体大多数组织内均可以发生,它具有无限增殖性,许多特性与干细胞相似。

1肿瘤细胞的来源与肿瘤干细胞:

从肿瘤细胞起源上看,在肿瘤发生机理的假说中,影响力比较大的主要有:基因突变假说,非整倍体假说,表遗传(epigenetic)改变假说;这是因为肿瘤细胞中总是存在基因突变,染色体结构和数目改变以及表遗传改变;关键问题是到底那种改变是肿瘤发生的启动改变,而其它改变只是后续结果,或者那种改变决定肿瘤的存在和演进。突出的学说对立有: Stochastic随机学说认为所有肿瘤细胞是功能同质的,每个肿瘤细胞都有再形成肿瘤的能力,但其进入细胞周期增生分裂是由一些低概率的随机事件控制.因此,要阐明肿瘤的生物学特性必须研究全部肿瘤细胞.而Hierarchy阶层学说认为,肿瘤细胞在功能上存在很大的异质性,只有极小部分肿瘤起源细胞(tumor—initiating cellT—IC)才有成瘤能力,这些细胞数量虽少,但是引起肿瘤的频率却很高.这种T—IC即为肿瘤干细胞,与其他肿瘤细胞不同,其具有自我更新和分化能力[8]因此,它与干细胞有一定的类似性,肿瘤组织里极少量的T—IC不同于其他大多数细胞,即使破坏了非T—IC细胞,使肿瘤缓解,但如果T—Ic依然存在,肿瘤还会复发。1994Lapidot d[9]人,首次通过特异细胞表面标志分离出了人急性粒细胞性白血病干细胞(1euttemic stem cellsLSC),发现只有LSC才具有不断自我更新维持其恶性显型的作用,证明了肿瘤干细胞的客观存在.03Al-Hajj报导[10-11]分离出CD44+CD24/lowLineage乳腺癌肿瘤干细胞和Singh[12-13]脑瘤中相继分离纯化出了具有特异表面标志的肿瘤干细胞,开创了实体肿瘤干细胞研究的新局面,结合间充质干细胞与肿瘤细胞在许多不同组织中均存在或可能发生的特点;并提出实体肿瘤也是一种干细胞类疾病的理论,肿瘤起源于正常干细胞遗传突变的积累。

如果是从肿瘤干细胞来源的肿瘤细胞,则不难推断:大部分肿瘤干细胞来自成体干细胞;肿瘤干细胞和成体干细胞在功能上的最大差别是肿瘤干细胞可以很容易发生扩增,并且可以无限扩增;而成体干细胞很难扩增,并且扩增能力有限;非整倍体可能恰好能够解释肿瘤干细胞和成体干细胞在功能上差别的现象,事实上建立的肿瘤细胞系是可以无限传代的,表明肿瘤干细胞的数目肯定也发生扩增,体外环境对于每个肿瘤细胞来说都基本一样,这样在细胞培养过程中由于普通肿瘤细胞数目扩增同时肿瘤干细胞也发生数目扩增;肿瘤干细胞分裂时产生一个肿瘤干细胞和一个普通的肿瘤细胞,即产生非整倍体;成体干细胞具有永生化DNA链的染色体表遗传与其它没有永生化DNA链的染色体的表遗传修饰可能不同,因此具有永生化DNA链的染色体可能正是决定干细胞命运的一种自我更新因素,因此可能恰好被非整倍体利用从而成为肿瘤发生的有效工具,因为非整倍体本身可导致干细胞中永生化DNA链的扩增和有丝分裂紊乱从而可能导致肿瘤干细胞产生;表遗传差别而不是基因突变可以解释成体干细胞和肿瘤干细胞在各自组织中只占少部分的现象,特定的表遗传决定细胞是否是干细胞或肿瘤干细胞,细胞表遗传差异产生主要是细胞不对称分裂的结果,决定干细胞发生不对称分裂的因素首先来自干细胞内部而不是来自细胞周围环境或其它普通的细胞,其本质可能是促进细胞分化的因素[14-15];干细胞总是倾向于发生不对称分裂是多细胞生物进化的结果,肿瘤持续不断生长的根本原因是肿瘤干细胞持续不断的扩增。

2.胚胎干细胞分化研究

Evans1981年首先建立了小鼠胚胎干细胞(ES)细胞系后,在此之后近20年内,人们相继自早期胚胎建立了猪、牛、兔、绵羊、山羊、水貂、仓鼠、灵长类动物(恒河猴、狨)和人类ES细胞系。ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态,一旦脱离饲养层就会自发地进行分化。当有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factorLIF)和/或饲养层细胞(如STO、小鼠胚胎成纤维细胞等)存在条件下,ES细胞以未分化的、多潜能的、贴壁的、细胞聚集体的方式生长。撤去LIF以及使ES细胞脱离饲养层细胞,然后将ES细胞消化成细胞悬液,在无粘附性的悬浮培养液中培养、使用“悬滴法”培养或使用半固体培养基(如甲基纤维素)培养,ES细胞都会形成EB。将离开LIF和饲养层细胞的ES细胞与造血基质细胞(如OP9细胞、RP.0.10骨髓基质细胞、ST2前脂肪细胞、S17骨髓基质细胞和卵黄囊内皮细胞系C166等)共培养,则不经EB形成过程即分化为造血细胞[16]。近几年,干细胞的研究又取得两个重大技术突破,一是人类胚胎干细胞在体外培养成功,实现了人类胚胎干细胞体外的非分化增殖。同时对胚胎干细胞进行定向分化研究也取得了明显的进展,小鼠研究表明:b-巯基乙醇可以使ES细胞发育成胚胎体,此阶段各细胞因子不利于胚胎体的的形成[17]

胚胎干细胞在胚胎细胞条件培养体系中加TPOSCF条件下可以使胚胎体细胞发育分化为造血干/祖细胞,诱导第六天流式细胞仪检测CD34+细胞为86%分阶段诱导、培养的目的是在其发育的不同阶段使用不同的微环境(说明干细胞分化主要受到外环境的影响),可以使胚胎干细胞高效地向造血干/祖细胞分化[18]干细胞研究中另一重大技术突破是成体干细胞的可塑性;所谓的成体干细胞实际是指不同组织中的间充质干细胞,(MSCs),它是广泛存在生物体骨髓内的一类干细胞,它最初是由Fnedemteinr发现的易于贴附于塑料培养板表面的细胞,它可在体外培养条件下大量增殖,又能保持高度末分化状态,在一定的诱导条件下可以定向分化为成骨细胞、软骨细胞、肌肉、脂肪细胞、血管内皮细胞等,例如:当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSEnestin呈阳性、GFAP阴性[19]

3.干细胞与肿瘤细胞比较

干细胞和癌细胞之间有惊人的相似,而自我更新能力和不稳定分化潜能是其最重要和最有用的特征,肿瘤可能通常起源于正常干细胞的转化,相似的信号通路可能既调节干细胞也调节癌细胞的自我更新这些细胞通过积累突变获得不确的增殖能力而转化为肿瘤干细胞或称为肿瘤起始细胞[20-21];因此可以认为肿瘤细胞是起源于干细胞并且:

3.1.干细胞的分化受阻,干细胞是突变的靶,即干细胞先发生突变,然后传给分化的子代,子代获自我更新能力,在此基础上又发生其它突变成为转化细胞。

3.2.组织内细胞的去分化变成幼稚细胞并且具有了分裂能力,从而转化为恶性肿瘤细胞,其中仅有肿瘤细胞的中1%~4%移植肿瘤细胞具有致瘤性,这部分细胞具有干细胞的特征,即自我更新以及分化成为其它组织类型的能力。

3.3.干细胞与肿瘤细胞在一定条件下是可以互相转化的:生殖嵴或胚胎植入人体内可以诱导成为畸胎瘤,而畸胎瘤细胞注入鼠囊胚内细胞团可以形成正常胚胎;我们在对间充质干细胞的研究中发现:将间充质干细胞注入裸鼠体内后均生长出恶性纤维瘤。

3..4.干细胞与肿瘤细胞均有无限增殖能力、自我更新能力、迁移(转移)能力、相似生长调控机制--Notch细胞信号转导途径的激活、Wnt信号途径的失调控、Shh—G1i途径的下调,等诸多信号转导途径与造血系统、表皮组织、乳腺组织以及肠上皮组织的干细胞自我更新、增生、分化失调而致恶性转化有关;这些与细胞生长分化有关的WntNotchBMI1依赖途径和SHH(Sonic hedgehog)通路的信号传导途径,是既往肿瘤发生不同的途径;这些相似的信号通路可能既调节干细胞,也调节癌细胞的自我更新[22-28]

 3.5.干细胞不同于肿瘤细胞之处是它生长的微环境,或称壁龛、生物位(niche)对其转化具有非常重要的作用,而对恶性肿瘤细胞生长影响而言,外环境相对影响要小,也就是说恶性肿瘤细胞具有更强的适应环境、继续生长的潜能。

4.分化微环境与高压氧微环境

4.1细胞环境下的高氧

不同的分化微环境决定了干细胞的分化方向,在细胞培养中及机体内均可以发现:一定程度缺氧可以促进细胞增殖,随着氧浓度的升高,培养中体系中细胞增殖表现为抑制现象[29];如吕安林等发现[30] 动脉平滑肌细胞的增殖随着培养环境中氧浓度升高而降低, 缺氧促进动脉平滑肌细胞的增殖, 高氧对动脉平滑肌细胞增殖具有显著的抑制作用;高压氧微环境中,氧极易大量溶解于水中,液体携氧不依赖于血红蛋白,随着给氧时间延长和给氧压力的升高,容易产生氧中毒;张谦慎[31]等人研究了Notch信号在高氧暴露下新生大鼠肺组织中的表达时发现: 高氧暴露导致新生大鼠的Notch受体/配体异常表达,参与了高氧肺损伤。长期暴露于85%的氧中,Notch1基因表达的向下调节可能是机体的一种保护性应激反应,是促进肺泡型细胞分化增殖的主要机制之一。Notch3活性上调可能是高氧导致新生大鼠肺发育阻滞的重要因素。陈平圣等[32]研究发现缺氧使肝星形细胞基质金属蛋白酶Ⅱ(MMP-2) 表达增加, 培养上清中MMP-2 酶活性明显降低,该影响在早期较明显;高氧则使MMP-2、基质金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ(TIMP-2) 、膜型基质金属蛋白酶Ⅰ(MT1-MMP) 的表达均增加,使酶活性增强。

4.2. 机体高氧环境时:

实验表明[33],在一定氧分压范围内,高压氧虽能使机体产生大量的自由基,消耗和灭活SOD,但机体受到刺激后,通过生物反馈信息传送和自身调节机制还能诱导或加快SOD的产生与合成,同时使过氧化物的合量降低。所以,高压氧既是活性氧所产生的前身物,也是SOD的产生的诱导物和对应物。氧暴露对机体细胞的抗氧化系统既有诱导作用也有抑制作用。

    氧中毒的临床症状是面色苍白出冷汗,头晕、恶心、甚至抽搐、咳效、呼吸急促,有的患者出现细胞溶血。由于氧在代谢过程中可以产生活性氧自由基,从而使氧对细胞有很大的毒性。高压氧对机体的最直接的有害作用是肺组织。机体暴露于高氧环境中增加氧自由基的产生,加剧细胞膜的胎质过氧化损伤。有报道认为,持续长时间给予高浓度纯氧或高压氧时,氧代谢增强,自由基作用加强,从而导致细胞内各种带巯基的酶,如SOD部分失活,丙二醛合成量增加,进一步促进DNARNA遗传信息的改变,促进发生细胞的脂质过氧化,使细胞膜上的受体和离子泵丧失其生物学功能,导致细胞破裂,组织损伤,脏器功能障碍,生物调节失控,甚至恶变和死亡。高压氧对放射治疗的增敏作用则也是明确的[34];当给大鼠吸1000mL纯氧气时,大鼠在60~72h内全部死亡。

细胞分化除了本身所具有的基因因素外,实际的基因表达调控主要受到外部环境影响,局部微环境是影响细胞分化的决定性因素;干细胞的分化控制一直是成体干细胞使用中最关键与敏感的问题,干细胞使用的安全性决定了干细胞是否能够真正走向实际应用, 探讨它们之间关系目的是为干细胞应用的安全性及肿瘤细胞恶性转化的外部环境上寻找可以控制的因素提供理论依据

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