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发表论文
作者: 吴桂英1,李宁2△,李启明3, 廖忠莉2,
题目: 卡铂对裸鼠移植结肠管状腺癌动物模型在高压氧微环境下的实验研究
刊名: 重庆医学
时间: 2009.04
期数: 38(8):903-904
•论 著•
卡铂对裸鼠移植结肠管状腺癌
动物模型在高压氧微环境下的实验研究

吴桂英1,李宁2△,李启明3, 廖忠莉2,
(1.重庆市肿瘤研究所内科,重庆 400030;2.第三军医大学新桥医院高压氧治疗中心, 重庆400037;2.第三军医大学新桥医院肿瘤治疗中心,重庆400037)

摘要 目的 探讨卡铂对裸鼠移植结肠管状腺癌动物模型在高压氧微环境下的作用。方法 通过对实验裸鼠肿瘤体积、重量、5-溴脱氧尿苷标记指数及组织病理学的变化进行观察。结果 高压氧微环下卡铂使移植瘤生长明显受到抑制,提示高压氧对卡铂有增敏作用,解剖和病理学未发现组织器官有癌细胞转移。结论 高压氧微环能改善肿瘤乏氧细胞的缺氧状态,提高肿瘤乏氧细胞对化疗药物的敏感性。因此,高压氧联合化疗能提高其疗效,能降低肿瘤的复发和转移,其治疗是安全和有效的。
关键词 高压氧;结肠管状腺癌;卡铂;

The animal model of Nude mice transplanted with Colon tubular adenocarcinoma treated by Carboplatin in the hyperoxic microenviroment

WU Gui-Ying1,LI-Ning2△, LI Qi-ming3, LIAO Zhong-li2
(1. Department of Internal Medicine, Chongqing Tumor Research Insitute, Chongqing 400030, China; 2. Center of HBO, Xinqiao hospital, Third Military Medical University ,Chong qing 400037,China ; 3. Center of cancer of PLA, Xinqiao hospital, Third Military Medical University ,Chong qing 400037,China)

Abstract: Purpose To evaluate the role of carboplatin to treat the nude mice model transplanted by colon tubular adenocarcinoma. Method Observe the change of the tumor volume, weight, 5 - bromo-deoxyuridine labeling index, and the phathology of nude mice. Result Under hyperoxic environment, carboplatin could inhibite the growth of grafted tumor, which indicate that hyperoxia could sensitize carboplatin. And there was no metastasis in
anatomy and phathology. Conclusion Hyperoxic microenviroment could improve the hypoxic condition of the hypoxic cell of tumor, and imcrease the sensitivity of tumor hypoxic cell to chemotherapy. Therefore, hyperoxia combine chemotherapy can improve the result of it, and decrease the metastasis and recurrence of tumor. This treatment is safe and effective.

Key words: Hyperbaric Oxygen ;colon cancer;carboplatin(CBP);

众所周之,由于肿瘤组织细胞生长快,其血管的形成和血管内皮细胞呈畸形生长,氧及营养物质不能满足肿瘤生长,使增殖期癌细胞转入静止期或变性坏死,癌细胞处于乏氧状态,研究发现乏氧的癌细胞的对放疗、化疗不敏感,这是治疗后复发及转移的主要原因。某些肿瘤在高压氧微环境下与放疗、化疗和光动力学等同步进行治疗上取得了一些实验和临床研究成果[1]。因此,我们试图通过动物实验进一步探讨在高压氧高压氧微环境下是否有促肿瘤增殖效应及能否有效地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、安全性,为临床治疗恶性肿瘤提供新的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验动物:所用20只实验BALB/c-nu/nu裸鼠均由第三军医大学附属二院动物室提供,雌雄各半,鼠龄为4-6周,体重20-26±8.6g。
1.2 材料来源:肿瘤组织新鲜标本均来自我校三所附属医院在院手术患者,均经病理细胞学诊断为结肠管状腺癌;卡铂(carboplatin,CBP)(华联制药厂50mg/支,批号200805),RPMI 1640,小牛血清(第三军医大学附属二院国家临床药理基地提供)。5-溴脱氧尿苷(Brdu,Sigma),抗-Brdu单抗(由重庆市肿瘤研究所提供)。
1. 3方法:
l.3.1癌细胞动物异体移植步骤 首先取肉眼无坏死区的胃管状腺癌手术组织标本,在0.05%先锋5号生理盐水中漂洗 4-5次。制成约1mm3小块浸浴在含20%小牛血清中的RPMI 1640液中备用。尔后,在非麻醉状态下,于BALB/c-nu/nu裸鼠左腹股沟皮下植入1mm3之肿瘤组织。然后在消毒无菌条件下,标准饲料喂养。
1.3.2肿瘤细胞传代方法 首先取生长45天的第1代肿瘤。在含20%小牛血清的RPMI 1640液中去坏死组织并制成1mm3之小块,快速病理切片证实为胃管状腺癌后,分别植入两只裸鼠的双侧腹股沟皮下(左右各2块)。然后,取第2代生长35天之肿瘤快速病理切片,病理形态未变。按上述方法在另两只裸鼠颈部皮下分别植入4mm3和3mm3肿瘤组织。
1.3.3观察实验瘤的形成过程 首先取生长35天的第3代肿瘤组织(病理检证实为胃管状腺癌),将肿瘤组织置于含20%小牛血清的RPMI 1640液中,剪碎后经纱布过滤,离心后去上清液。随后取离心后的细胞液,用排斥法计数肿瘤细胞数。再用含20%小牛血清的RPMI1640液稀释并配成2×106/ml细胞悬液。20只裸鼠在非麻醉状态下,分别在其颈部皮下分别注射0.5ml细胞悬液。密切观察裸鼠及肿瘤的生长情况,当肿瘤长出后开始测量其肿瘤大小,每3天测量1次,根据公式V=π/6•X3(测定3次直径的平均值)。计算肿瘤体积(V),按照平均体积绘制生长曲线。
1.3.4 高压氧微环境曝露方法 实验曝露方法:动物实验舱采用DWC150/300型(山东烟台持久集团高压氧舱有限公司制造),动物进舱,用纯氧洗舱10min,加压速度率为100kPa/min,加压到0.25Mpa,停留80min,停留中用纯氧通风10 min,尔后在10 min内匀速减压至常压,出舱,每日1次,共9次。将52天后将长出肿瘤的实验肿瘤裸鼠随机分成4组,见下表。
20只实验肿瘤裸鼠随机分组情况
组别 例数
(只) 压力
(Mpa) 氧浓度 HBO曝露方法 HBO曝露时机
A组 空白对照 5
B组 (HBO+H2O) 实验对照 5 0.25 纯氧 80min,1次/d×9day 53天后
C组 (CBP) 5
D组 (HBO+ CBP) 实验组 5 0.25 纯氧 80min,1次/d×9day 53天后
实验肿瘤裸鼠入舱前10分钟,B组腹腔内注射生理盐水0.5ml/只。C组与D组腹腔内注射CBP 2.5mg/kg/只。高压氧曝露完成后,让体内残留药物继续起效3天,并观察裸鼠生长情况。同时,在处死裸鼠前15小时腹腔内注射Brdll 50g/kg/只,进行肿瘤体内标记;处死裸鼠后完整分离出皮下肿瘤并测量肿瘤3个不同直径,计算其体积(V),同时称其重量(W)、测量标记指数和常规病理细胞学检查,并观察记录实验肿瘤裸鼠肝、肺、肾有无肿瘤转移灶。
1.2.4标记指数测定 标记指数的测定按胡氏[2]介绍的方法进行。被标记的S期细胞核呈均匀红染,未标记的核呈兰染,用单盲法在光镜下计数1000个细胞,记录总细胞数和被标记细胞数,标计指数(LI)按下列公式计算:LI-BrdU标记阳细胞数/总细胞数×100%。
1.2.5资料分析 用q检验对实验数据进行统计学分析。
2.结 果
2.1实验肿瘤裸鼠生长情况 第3代人胃管状腺癌裸鼠皮下移植,3周后可见皮下肿瘤。以后有一个较快的生长期。实验开始后B组(HBO组)再出现一个加速生长期,而A组(空白对照)和C组(实验对照)基本呈水平生长,D组(实验组)肿瘤体积生长曲线下降。
2.2实验肿瘤裸鼠生长情况统计学分析 各级之间肿瘤的体积和重量经统计学处理,除A组与C组之间无统计学意义(提示单用CBP无明显效果)外,其它各组之间均有统计学意义。A组与B组比较,肿瘤体积(V)和重量(W)(P<0.05)提示HBO能促进肿瘤增殖。A组与D组比较V,W(P<0.05)提示HBO加CBP有明显的抗癌效应。D组与C组比较V,W(P<0.01),说明CB加HBO抗裸鼠人大肠癌模型效果明显优于单用CBP。
2.3实验肿瘤裸鼠的肿瘤的标记指数情况 A组与B组比较P<0.01,A组与C组比较P>0.05,A组与D组比较P<0.01,提示应用HBO组肿瘤的标记指数高于未应用HBO组。
2.4实验肿瘤裸鼠组织器官解剖情况 解剖处死后的实验肿瘤裸鼠,发现所有裸鼠肝、肺、肾多切面观察未见肿瘤转移灶。肿瘤的分化程度降低。D组坏死区大于另三组。
3.讨论
近年来,结直肠癌的发病率以一定的速度上升,在我国约为每年 4.2%[3]。手术一直是公认的首选治疗方法,放化疗则是针对转移复发或晚期结直肠癌的主要治疗手段。近年来随着现代药理学及分子生物学的发展,对恶性肿瘤的生物学特性有了进一步了解;同时,化疗药物和其它技术共同应用,也推动了辅助治疗在结肠癌综合治疗中的作用。
结直肠癌的发病率与死亡率在我国近年来有逐年上升的趋势。大部分患者在诊断的初期就已是晚期,已失去手术切除的机会。因此药物治疗仍是结直肠癌治疗中不可缺少的重要手段。结直肠癌仍是一类对化疗相对不敏感的恶性肿瘤,特别对于晚期患者的治疗效果往往不太理想。所以对每一位医生来说,必须清楚的了解每一类药物的作用、地位,以及对患者的收益度和效-价比。
目前,人们试图通过各种方法来提高放疗和化疗在治疗恶性肿瘤中的作用或降低其毒副作用。Gray等报道X线的生物学效应在氧供好的条件下比乏氧状态下增强三倍。Henk等在HBO中进行头颈部肿瘤的放射治疗,肿瘤局部治愈率明显提高,病人生存期延长。在肿瘤的富氧区与坏死区之间有一个乏氧细胞亚群约占肿瘤细胞总数的1-79%。G2期肿瘤细胞为“停滞”增殖状态细胞及乏氧细胞对放疗和现在大多数细胞周期特异性化疗药物很不敏感,在放疗或化疗结束后重新进入细胞周期或恢复肿瘤干细胞行为而使肿瘤难以局部治愈及治后复发。且复发的肿瘤比原来的肿瘤具更快的生长速率。这种加速增殖是肿瘤抗放疗、化疗的主要原因,也就是说肿瘤中乏氧细胞亚群的存在可能是放疗、化疗局部治疗失败及治后复发的根源。
本实验空白组与HBO组比较肿瘤的标记指数、体积和重量差别显著,提示HBO有促进肿瘤增殖效应。其意义在于HBO可使处于G2期状态细胞及具有缓慢细胞周期或未进入细胞周期的乏氧细胞其中包括肿瘤干细胞)再充氧而进入细胞周期。利用这一现象可望提高放疗、化疗的疗效,提高肿瘤局部治愈率,减少治后复发的机会。
CBP是通过铂离子与 DNA链上的碱基形成交叉联结,从而破坏 DNA的结构和功能,导致细胞死亡,属于细胞周期非特异性药物。耐药性方面 ,因细胞可通过错配修复而去除新合成的 DNA错配 ,不引起细胞周期停止和细胞死亡 ,导致对 DDP及 CBP的耐药[4]。血管内皮生长因子 (VEGF)是目前发现的最强大、 最专一的刺激血管内皮生长的因子[5]。由于血管发生不仅为肿瘤提供营养和氧气 ,还是肿瘤细胞进入系统循环和转移的通路 ,因此 VEGF在包括结直肠癌在内的大多数肿瘤中起正调节作用。VEFG选择性直接作用于血管内皮细胞膜上的血管内皮生长因子受体 (VEGFR) ,该受体为酪氨酸激酶受体之一 ,它被激活后通过细胞内信号转导系统 (主要为Ras2 Raf2 ERK及 Src2 FAK)可以产生促进细胞分裂、机动蛋白重组、内皮细胞增殖、 提高血管通透性、 改变细胞外基质等作用,高压氧微环境能改变因VEGFR而造成的乏氧状态.
牛耀文等[6]观察顺铂(DDP)和高压氧对小鼠 H22 和 S2180 肿瘤抑瘤率的影响 , HBO + DDP 对小鼠 H22 和 S2180 肿瘤的抑瘤率分别为 51. 91 %和 46. 99 % ,单用 DDP 组为 32. 26 %和26. 28 %( P < 0. 05) 。肿瘤的体积和重量,HBO加CBP组与空白组对比差别显著而单用CBP组空白组比较无差异。同时,单用C、D组与CBP加 HBO组对比差别也非常显著。提示HBO加CBP抗裸鼠人胃管状腺癌模型效果明显优于单用CBP。CBP是一种广谱重金属抗癌药,其作用机理主要是[7]:铂在DNA合成过程中可与DNA形成键内、链间交叉联结。妨碍DNA复制。并不表现明显的细胞周期特异性。HBO增强CBP抗癌作用的主要机制可能是[8,9,10]:(1)实体瘤在生长过程中随着肿瘤的增大,绝大多数情况下血管的形成跟不上肿瘤生长的需要而出现肿瘤内乏血管区。文献报告HBO可改善组织的微循环。因而推测肿瘤组织的局部药物浓度升高以及药物到达的范围扩大;(2)由于毛细血管对新生肿瘤的营养物质供应增加,氧的弥散距离增大,乏氧细胞再充氧,大量G0期细胞进入增殖期,即肿瘤组织内部的乏氧及缺氧区的癌细胞大部分处于静止期(Go), Go期细胞对化疗药物不敏感,在高压氧环境下,癌细胞的缺氧状况改善,使Go期癌细胞进入增殖期,增殖期细胞对化疗敏感,从而使“休止期”细胞进入细胞周期,缓慢细胞周期细胞DNA合成加速,CBP效应因之增强;(3)CBP通过肿瘤细胞膜可能是一个主动转运的过程,需要Na+-K+ATP酶的参与,肿瘤中乏氧细胞亚群由于氧供不足,细胞膜及线粒体嵴肿胀,ATP产生减少,药物难以通过膜通道,而HBO可以减轻水肿,增加ATP产生,Na+-K+ATP酶增加,提高细胞膜的通透性。(4) 阻止DNA复制:①干扰嘌呤、核苷酸的合成,抑制DNA、RNA复制,这是因为高压氧通过氧自由基使DNA的肽链发生空间位置的改变,增加对抗癌药物的敏感性。②使DNA的肽链断裂,可与抗癌药物起协同作用。③破坏或抑制修复DNA肽链的DNA连接酶妨碍对受损的DNA修复。
(5)降低酶的活性,酸碱平衡失调:在高压氧作用下,癌细胞内的某些酶的活性下降,癌细胞的有氧氧化,无氧酵解增强,ATP生成减少,乳酸等酸性物质增多,致使癌细胞抵抗抗癌药物的能力下降,化疗药物最大限度地杀伤癌细胞。
有作者报道胃管状腺癌细胞是液小鼠皮下注射后,3~6天内能摸到上下结节。而本实验2周后方可摸到皮下结书,3周皮下结书始可测量。这可能与肿瘤株生长速率及倍增时间不同有关。有人报道HBO在减压过程中可能增加肿瘤转移的机会,本组实验未见此现象。
  HBO可提高肿瘤组织对化学药物的敏感性[11,12]。Alagoz等将72只卵巢癌模型小鼠随机分为 2 组:单纯组接受单纯化疗, HBO 组在化疗的同时接受 HBO 暴露,2周后HBO 组小鼠体内有新生血管形成(P<0.01),而且瘤体生长速度与单纯组比较明显减缓(P<0.05) ,正是这些新生血管增加化疗药在瘤体内的浓度,从而达到 HBO 对化疗增敏的效果;本实验通过裸鼠人胃管状腺癌模型用CBP加HBO进行化疗,观察到HBO有促肿瘤增殖及增强CBP的抗癌效应。这与本实验结果是一致的。
总之,高压氧在这一领域的应用为大肠癌的化疗提供了一个可行的新途经,希望成为临床综合治疗恶性肿瘤患者的一种安全、有效和毒副作用小新手段,使恶性肿瘤患者生存时间延长、生活质量提高,为在一新方法得到广泛推广应用而提供理论依据。


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