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发表论文
作者: 王晓红1,邵彬1,王 琴1,李 宁2△
题目: 高压氧治疗对脊髓损伤后大鼠神经细胞凋亡及行为学评分的影响
刊名: 重庆医学
时间: 2010.04.30
期数: 39(8):935
•论著•
高压氧治疗对脊髓损伤后大鼠神经细胞凋亡及行为学评分的影响
王晓红1,邵彬1,王 琴1,李 宁2△
(1.广州军区武汉总医院康复理疗科,武汉430070;2.第三军医大学新桥医院高压氧治疗中心,重庆400037)
摘 要:目的 观察高压氧治疗对脊髓损伤后SD大鼠的神经细胞凋亡及行为学评分的影响。方法 雄性SD大鼠48只,随机分为高压氧治疗组、对照组及伪手术组,每组各16只大鼠(n=16),每组又分为4个时间点,分别为脊髓损伤后6小时、12小时、24小时和72小时,其中每个时间点高压氧治疗组大鼠4只,对照鼠4只和伪手术鼠4只。高压氧组和对照组采用脊髓横切法造成脊髓损伤模型,高压氧治疗组大鼠在每个时间点给予高压氧治疗后即处死,对照组和伪手术组在伤后相应时间点处死。用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法标记凋亡细胞,用改良的TARLOV评分评估大鼠后肢运动功能。观察比较各时间点的凋亡指数和改良的TARLOV评分的差异。结果 伪手术组未见凋亡阳性细胞;凋亡细胞在伤后6小时即出现在脊髓组织中,24小时与72小时凋亡细胞数显著增加;与对照组相比,高压氧治疗组的TUNEL阳性细胞显著减少(P<0.05);同时,高压氧组大鼠改良的TARLOV评分显著高于对照组(P<0.05)。结论 高压氧治疗能够显著减少脊髓损伤后大鼠神经细胞凋亡并改善大鼠后肢运动功能,对脊髓损伤后的神经细胞具有很好的保护作用。
关键词:高压氧;脊髓损伤;凋亡;改良的TARLOV评分

Effects of Hyperbaric Oxygen on apoptosis of nerve cells
And motor function after spinal cord injury

WANG Xiao-hong1, SHAO BIN 1, WANG Qin1.LI Ning2△
(1.Dept. of Physical Medicine and Rehabilitation, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Comand, Wuhan 430070, China;2. Center of HBO , Xinqiao Hospital , Thi rd Military Medical University , Chongqing 400037 , China)
Abstract: Objective To investigate effects on hyperbaric oxygen(HBO) on apoptosis of nerve cells and motor function after spinal cord injury. Methods 48 SD male rats were randomized into three groups: hyperbaric oxygen group (n=16), control (n=16)and sham-operate group (n=16). Rats sacrified at 6 hours, 12hours, 24 hours and 72 hours post injury, among which rats in HBO group were received HBO therapy before killing at each time point. Apoptosis Index and improved Tarlov’s score were calculated at each time point. Results No apoptotic cell appeared in sham group. The apoptosis cell could be observed at 6 hours post-injury, and elevated from 24 to 72 hours. Compared to HBO group, the TUNEL-positive cells were significantly higher in control group(P<0.05). Improved Tarlov’s score were lower in control group than that of HBO group (P<0.05).Conclusion HBO therapy could reduce protect nerve cell from apoptosis after spinal cord injury in rats and improve their motor function.
Key words:hyperbaric oxygen;spinal cord injury; apoptosis; improved Tarlov’s score
高压氧用于治疗脊髓损伤具有显著的临床效果,其作用机制尚在讨论中。有研究表明,高压氧可以改善脊髓损伤患者的临床结局[1] [2] [3] [4]。本文作者的目的在于进一步明确高压氧治疗对脊髓损伤后大鼠神经细胞凋亡的影响及行为学评分的改善。
1. 材料与方法
1.1实验动物及分组 雄性SD大鼠48只,体重150-190克,普通级,购自广州军区武汉总医院医学实验中心。大鼠随机分为高压氧组16只,对照组16只,伪手术(sham-operate)组16只;每组又分为4个时间点,分别为脊髓损伤后6小时、12小时、24小时和72小时,其中每个时间点高压氧治疗大鼠4只,对照鼠4只和伪手术鼠4只。饲养温度为20-23℃,湿度为50%-60%,大鼠可以在笼中自由饮食水。
1.2动物模型的建立 采用脊髓横切法,称取大鼠体重后,水合氯醛溶液按4ml/Kg给予腹腔内注射麻醉,然后用电子剃毛器剃去大鼠背部毛发,按T12为中心显露直径约为0.5cm的圆形无菌区,作为脊髓损伤区。将大鼠固定在鼠台上,以T12棘突为中心背部正中纵行切口,长约3cm,显露脊柱后,在T11-T12之间用血管钳小心咬除棘突和双侧椎板露出白色的脊髓后,用眼科剪或手术刀切断脊髓,然后依层次缝合。照模成功的标志是大鼠的双下肢出现回缩性扑动、尾巴呈痉挛性摆动。伪手术组大鼠只给予椎板切除,不横切脊髓。所有大鼠术后给予青霉素抗感染治疗。
1.3高压氧处理 所有大鼠于手术后1小时进舱,先用纯氧充分洗舱, 使舱内氧浓度>95%, 再以0.0125Mpa/min的速率加压至0.2Mpa。在高压下停留60mins, 其间用纯氧通风10mins。停留毕, 匀速减压至常压。对照组及伪手术大鼠亦置于高压氧舱内, 模拟除压力、氧浓度以外的其他过程和环境条件。术后6小时,分别处死该时间点实验大鼠并取材;剩下大鼠按各时间点,即12小时、24小时及72小时均接受上述处理后依次处死并取材。
1.4 取 材 大鼠处死前给予10%水合氯醛溶液麻醉后开胸暴露心脏,心脏灌注冰生理盐水至流出液为清亮后给予4%的多聚甲醛溶液继续灌注,灌注完成后取出受损脊髓节段头端3mm,尾端3mm的脊髓组织,放入同灌注液中,置入4℃冰箱过夜。酒精脱水石蜡包埋并切片,切片为头端5μm,尾端5μm各一张。
1.5脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUDP-biotin nick end-labeling,TNNEL)标记凋亡细胞:TUNEL试剂盒由德国Roche公司提供,实验步骤按试剂盒说明书进行;用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。高倍视野下(×400)计算凋亡指数,凋亡指数是指每张TUNEL阳性切片选取5个阳性细胞数(细胞核中有棕黄色颗粒者)最多的,根据公式:凋亡指数=凋亡细胞核数/总细胞核数计算。
1.6 改良的Tarlov评分(空地行走评分):各组大鼠处死前均进行改良的Tarlov评分,比较各组间分值差异。
1.7统计学分析 应用统计软件SPSS 13.0进行统计分析,P<0.05表示有统计学意义;先对数据进行正态性检验(One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test),均满足正态性检验,计量数据描述采用 ±s 表示,先进行两因素方差分析,再进行两个独立样本t检验和单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间两两比较采用Tukey法。
2.结 果
伪手术组大鼠各时间点脊髓组织中未见凋亡细胞,改良的TARLOV评分5分。TUNEL阳性细胞在脊髓损伤后6小时即出现在高压氧组和对照组的脊髓组织中,24小时与72小时凋亡细胞数显著增加;与对照组相比,高压氧治疗组的TUNEL阳性细胞在12小时、24小时及72小时显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05);(见图1,表1)
图1 TUNEL阳性细胞表达(原位末端标记法,×400)

6小时对照组 6小时高压氧组 12小时对照组 12小时高压氧组

24小时对照组 24小时高压氧组 72小时对照组 72小时高压氧组

表1 不同组别在各个时间点下凋亡指数比较分析结果( ,%)
组别 n 6小时 12小时 24小时 72小时
对照组 16 19.40±1.34 25.73±2.57 48.83±2.69 52.47±4.73
磁刺激组 16 18.87±2.63 23.42±0.18* 29.37±4.11** 41.09±3.07**
注: *表示高压氧组和对照组比较P<0.05,**表示高压氧组和对照组比较P<0.01。
脊髓损伤后6小时,高压氧组和对照组改良的TARLOV评分均为0分;伤后12小时,高压氧组分值显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);伤后24小时及72小时,高压氧组改良的TARLOV评分分值明显高于对照组(P<0.01)。(见表2)
表2 不同组别在各个时间点下改良的TARLOV评分比较分析结果( ,%)
组别 n 6小时 12小时 24小时 72小时
对照组 16 0 0.37±0.02 0.98±0.76 2.04±0.90
磁刺激组 16 0 1.09±0.15# 1.83±0.47## 2.87±0.31##
注: #表示高压氧组和对照组比较P<0.05,##表示高压氧组和对照组比较P<0.01。
3.讨 论
脊髓损伤造成损伤平面以下的功能障碍及丧失。脊髓损伤后中枢神经细胞发生一系列细胞和分子事件,包括炎症反应,坏死和凋亡。除了损伤部位的原发性损伤外,近来越来越多的研究结果表明,继发性损伤在急性脊髓损伤后扮演了重要角色,而凋亡是引起脊髓继发性损伤的主要机制。凋亡是细胞主动的程序性死亡,其特征是核染色质浓缩,细胞核萎缩和/或DNA裂解。脊髓损伤后,细胞凋亡发生的部位主要在白质,引起了轴突Wallerian退变,其中主要的凋亡细胞是神经元细胞和少突胶质细胞,凋亡导致大范围少突胶质细胞的丢失甚至可以发生在离原发性损伤部位较远的节段[5] [6] [7]。目前对于脊髓损伤的研究的热点之一在于如何预防和逆转脊髓损伤后继发性损伤,尽可能保留受损脊髓残存的结构和功能。越来越多的研究证明,神经细胞的凋亡在脊髓损伤后的继发性损伤机制中扮演了重要的角色。
高压氧作为一种有效的治疗手段用于中枢神经系统损伤的治疗取得了肯定的临床疗效,包括卒中、创伤性颅脑损伤以及脊髓损伤的患者,但是其作用机制尚处于研究阶段。国内有学者报导,高压氧可以降低大鼠缺血缺氧性脑损伤后神经细胞的凋亡及其关键酶Caspase-3的表达[8] [9];也有学者报导了高压氧除了能够减少脊髓损伤后神经细胞的凋亡[10],还可以显著升高脊髓组织中兴奋性氨基酸EAA(Glue)的水平[11]以及神经生长相关蛋白GAP-43的表达[12]。
我们通过研究高压氧对于脊髓损伤后大鼠神经细胞凋亡的影响发现,高压氧能够显著减少神经细胞的凋亡,对脊髓损伤后的脊髓组织具有保护作用,而且高压氧治疗具有剂量累加效应,随着治疗次数的增加,高压氧组的凋亡细胞比对照组显著减少(P<0.001)。同时,我们使用改良的TARLOV评分对脊髓损伤后大鼠的后肢功能进行了评价,发现高压氧治疗可以显著改善脊髓损伤后大鼠后肢的运动功能。

参考文献:
[1]俞友皆,黄莘莘. 早期高压氧治疗对不完全性颈髓损伤患者神经功能恢复的影响. 实用医学杂志,2008,24(9):1559-1561
[2]郭根平,张谦,杨玲玲. 早期高压氧治疗对脊髓损伤患者功能恢复的影响中国康复理论与实践. 2005,11(9):758
[3]臧谋圣,方健,吴健等.高压氧早期治疗颈脊髓不完全损伤疗效观察.颈腰痛杂志,2005,26(6):451-452
[4]印卫锋,郭风劲,陈安民.高压氧治疗胸腰椎骨折合并脊髓损伤.中国康复,2004,19(5):292-293
[5]Fehlings. M.G, Casha. S, Yu. W.R. FAS deficiency reduces apoptosis, spares axons and improves function after spinal cord injury. Exp. Neurol, 2005 , 196: 390-400
[6]Demjen. D, Klussmann. S, Kleber. S et al. Neutralization of CD95 ligand promotes regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Nat. Med, 2004, 10:389-395
[7]Takagi. T, Takayasu. M, Mizuno. M, et al. Caspase Activation in Neuronal and Glial Apoptosis Following Spinal Cord Injury in Mice. Neurol. Med. Chir, 2003, 43:20-30
[8]蒋杞英,霍本良.高压氧对大鼠局灶性脑缺血再灌注神经细胞caspase-3表达的影响. 中华物理医学与康复杂志,2006,28(12):852-854
[9]檀国军,牛彦平,王玲.高压氧降低缺血缺氧性脑损伤大鼠脑组织内caspase-3表达.基础医学与临床,2008,28(8):846-849
[10]卢培刚,冯华,王宪荣等.高压氧预处理对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响. 中国微侵袭神经外科杂志,2008,13(4):173-175
[11]方健,候铁胜,方以君.高压氧对脊髓损伤大鼠脊髓组织中兴奋性氨基酸的影响.解放军医学杂志,2002,27(11):1014-1015
[12]王刚,刘世清. 高压氧对鼠损伤脊髓内神经生长相关蛋白表达的影响. 中华物理医学与康复杂志,2004,26(12):712-714
 
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